Bekanntmachung der Stellungnahme der Zentralen Kommission für die Biologische Sicherheit zur Eignung von etablierten Laborstämmen von Komagataella phaffii als Teil biologischer Sicherheitsmaßnahmen gemäß § 8 Absatz 1 der Gentechnik-Sicherheitsverordnung (BVL 131/2025/4)

Nach § 7 Absatz 5 GenTSV ist es erforderlich, dass neue biologische Sicherheitsmaßnahmen (hier: Vektor- und Empfängersysteme) durch die Zentrale Kommission für die Biologische Sicherheit anerkannt werden müssen. Unter § 8 Absatz 1 GenTSV wird ausgeführt, nach welchen Voraussetzungen die Verwendung eines Empfängerorganismus als Teil einer biologischen Sicherheitsmaßnahme anerkannt werden kann. Diese sind erfüllt, wenn 1. eine wissenschaftliche Beschreibung und eine taxonomische Einordnung des Empfängerorganismus vorliegen, 2. die Vermehrung des Empfängerorganismus nur unter Bedingungen möglich ist, die außerhalb gentechnischer Anlagen selten oder nicht angetroffen werden, 3. der Empfängerorganismus für Mensch, Tier und Pflanzen nicht pathogen ist und keine umweltgefährdenden Eigenschaften aufweist und 4. der Empfängerorganismus nur einen geringen horizontalen Gen­austausch mit anderen Spezies betreibt.

In dieser Stellungnahme wird geprüft und bewertet, ob etablierte Laborstämme der Spezies Komagataella phaffii die oben genannten Voraussetzungen erfüllen.

1.1 Wissenschaftliche Beschreibung

Die Spezies Komagataella phaffii (vormals: Pichia pastoris) gehört zur Familie der Phaffomycetaceae [1, 2]. Die Familie umfasst Hefen, die sich durch Knospung vermehren und gehört zu den Ascomyceten [3]. K. phaffii wurde erstmalig 1954 aus dem Exsudat einer kalifornischen Schwarzeiche aus dem Yosemite-Nationalpark isoliert. Die Spezies kolonisiert das Exsudat von Bäumen [4]. K. phaffii-Zellen sind methylotroph, aerob und haben eine ellipsoide oder sphäroide Form [1]. Stämme der Spezies sind primär haploid und vermehren sich vegetativ, können sich jedoch unter Stickstoff-limitierten Kulturbedingungen auch sexuell fortpflanzen [5].

Unter nährstoffreichen Bedingungen vermehrt sich K. phaffii ungeschlechtlich durch Knospung. Wenn Stickstoff­quellen fehlen und geeignete Kohlenstoffquellen vorhanden sind, können sich K. phaffii-Zellen kreuzen [5]. Die sexuelle Fortpflanzung ist homothallisch, das heißt unabhängig vom mating type(MAT)-Kreuzungstyp. Zellen können nach Induktion der Fortpflanzung eine 138 kbp große Region auf Chromosom 4 invertieren und somit ihren Kreuzungstyp ändern (sog. mating type switching) [6]. Bei der Kreuzung fusionieren zwei Zellen unterschiedlicher Kreuzungstypen zu einer MATa/​MATα-diploiden Zelle. Im Anschluss kommt es zur meiotischen Teilung, bei der vier haploide Ascosporen entstehen [4]. Die Rekombinationsrate während der Meiose ist in K. phaffii circa 3,5-fach niedriger als in Saccharomyces cerevisiae und liegt bei circa 25 crossover-Events pro Meiose [4].

Die ersten K. phaffii-Isolate wurden ab den 1960er Jahren in der Stammsammlung der Universität von Kalifornien gelagert. Alle in der Grundlagenforschung und Biotechnologie genutzten K. phaffii-Stämme lassen sich auf einen Stamm (NRRL Y-11430; Synonym CBS 7435) zurückführen, der sich von einem der 1954 isolierten Stämme aus dieser Stammsammlung ableitet [7]. Aufgrund der methylotrophen Eigenschaft der Hefe patentierte die Philips Petroleum Company 1979 diesen Stamm. Aufgrund einer Verkürzung des Leserahmens des HOC1-Gens ist die Struktur der Mannan-Zellwand des Stammes verändert, was die Transformierbarkeit und Proteinsekretion verbessert [7]. Ursprünglich war die Verwendung der Hefe als proteinreiches Futtermittel geplant, jedoch führte die Öl-Krise der 70er Jahre zu steigenden Methanolpreisen, sodass die Produktion im Vergleich zu anderen proteinreichen Futter­mitteln wie Soja nicht mehr konkurrenzfähig war. In den folgenden Jahren wurde der Stamm als Plattform zur Proteinexpression eingesetzt und die Patente wurden 1993 an weitere Lizenznehmer abgegeben [8]. Seit 2023 steht auch ein lizenzfreier K. phaffii-Stamm (NCYC 2543) mit Expressionssystemen zur Verfügung, der sich ebenfalls aus der Stammsammlung der Universität von Kalifornien ableitet und dessen Genomsequenz mit der von NRRL Y-11430 praktisch identisch ist [7]. K. phaffii wird primär als Proteinexpressionsplattform in der Grundlagenforschung und Biotechnologie eingesetzt [9–11]. Die spontanen und eingeführten Mutationen von K. phaffii-Stämmen sind vielfältig und gut charakterisiert [7, 8]. Die Genome verschiedener Laborstämme von K. phaffii sind vollständig sequenziert [7, 12]. Die beiden zuvor genannten Stämme (NRRL Y-11430 und NCYC 2543) und ihre Derivate werden im Folgenden als etablierte Laborstämme von K. phaffii bezeichnet.

Bei den etablierten Laborstämmen von K. phaffii handelt es sich um wissenschaftlich sehr gut charakterisierte Modellorganismen mit einer taxonomisch eindeutigen Einordnung.

1.2 Pathogenes Potenzial von Komagataella phaffii

Es liegen keine Berichte über Infektionen mit K. phaffii beim Menschen, in Tieren oder in Pflanzen vor. Das Genom von K. phaffii weist keine Virulenzfaktoren auf, wie sie in anderen pathogenen Hefen vorkommen [12 – 14]. Pathogene Hefen besitzen häufig die Fähigkeit zum Pseudohyphenwachstum. K. phaffii besitzt die FLO-Gencluster, die diesen Phänotyp ermöglichen, jedoch erfolgt die Aktivierung dieser Gene und Ausprägung des Phänotyps nur bei niedrigen Wachstumsraten, hohem pH und Stickstoff- und Kohlenstofflimitierung [15, 16].

Das pathogene Potenzial von etablierten Laborstämmen der Hefe wurde in unterschiedlichen Tiermodellen untersucht. Im Mausmodell führte die intravenöse Injektion von 1 × 10⁶ koloniebildenden Einheiten (KBE) von K. phaffii nicht zu pathologischen Veränderungen in verschiedenen Gewebetypen der Maus [17]. Die Hefezellen wurden spätestens 144 Stunden nach Injektion eliminiert. Inokulierte Mäuse blieben gesund und waren hinsichtlich der Nahrungsaufnahme und ihrem Körpergewicht unauffällig. Als Kontrolle wurde Mäusen dieselbe Menge eines pathogenen Candia albicans-Stamms verabreicht. Mit C. albicans infizierte Mäuse verloren stark an Gewicht und verstarben im Zeitraum von sechs Tagen. In einer weiteren Untersuchung im Mausmodell wurde die orale Gabe von 1 × 10⁷ KBE von K. phaffii untersucht [18]. Es konnte gezeigt werden, dass nach 72 Stunden nur noch sehr wenige K. phaffii-Zellen im Magen-Darm-Trakt nachweisbar waren. Bei den Versuchstieren wurden keine pathologischen Effekte oder Veränderungen des Verhaltens beobachtet. Bei Untersuchungen in Masthühnern hatte die Fütterung von 1 × 10⁶ bis 10⁷ KBE K. phaffii je g Trockenfutter über einen Versuchszeitraum von mehreren Wochen keine negativen Effekte [19, 20]. Die Fütterung von 1 × 10⁷ KBE K. phaffii je g Trockenfutter an Wachteln über mehrere Wochen beeinträchtigte ebenfalls nicht die Gesundheit der Tiere [21]. Die Haltung von Salinenkrebsen in Aquariumwasser mit einer Konzentration von 10⁷ KBE K. phaffii je ml hatte keine negativen Auswirkungen auf die Krebse [22].

Zusammenfassend zeigt sich, dass etablierte Laborstämme von K. phaffii apathogen sind und kein Risiko für den Menschen, Tiere und Pflanzen darstellen.

1.3 Vermehrungsfähigkeit von etablierten Laborstämmen von Komagataella phaffii außerhalb gentechnischer An­lagen

Beim Einbringen von NRRL Y-11430-abgeleiten K. phaffii-Stämmen in nicht sterile Flusswasserproben reduziert sich die Zellzahl von 5 × 10⁶ KBE je ml um vier Zehnerpotenzen innerhalb von 20 Tagen [23]. Nach 70 Tagen in nicht sterilen Flusswasserproben überlebten nur noch wenige K. phaffii-Zellen (Reduktion um sechs Zehnerpotenzen) [23]. In Suspensionen von nicht sterilen Bodenproben (Ackererde) in nicht sterilem Flusswasser sank die Zellzahl der NRRL Y-11430-abgeleiteten K. phaffii-Stämme innerhalb von zwölf Tagen um drei Zehnerpotenzen auf höchstens 10² KBE je ml Erdsuspension und innerhalb von 30 beziehungsweise 70 Tagen um sechs Zehnerpotenzen (stammabhängig) [23]. In beiden Untersuchungen konnte keine Stagnation der Zellzahlreduktion beobachtet werden. Es ist daher davon auszugehen, dass keine einzelne Subpopulation der Hefe in Boden- und Wasserproben überlebte.

Als Kontrolle wurde der als Teil einer biologischen Sicherheitsmaßnahme anerkannte Saccharomyces cerevisiae-Stamm S288c eingesetzt [23]. Die Zellzahl des S. cerevisiae S288c-Stamms reduzierte sich in den Flusswasserproben nach 70 Tagen von 1 × 10⁶ KBE je ml um sechs Zehnerpotenzen. In den Bodenproben reduzierte sich die Zellzahl innerhalb von zwölf Tagen um drei Zehnerpotenzen. Mangels eines ausreichend selektiven Mediums gegen die natürlichen Keime in den Umweltproben konnten keine weiteren Daten zu späteren Zeitpunkten erhoben werden.

Diese Daten zeigen, dass etablierte Laborstämme von K. phaffii nur für eine relative kurze Zeit in der Lage sind, in Böden und Gewässern zu überleben. Eine dauerhafte Etablierung in der Umwelt ist nicht zu erwarten.

1.4 Gentransfer von Komagataella phaffii zu anderen Organismen

Im Gegensatz zu verschiedenen Bakterienspezies sind Pilze allgemein nicht in der Lage, DNA aktiv via Konjugation und Transformation zu übertragen [24 – 26]. Auch für K. phaffii liegen keine Hinweise auf eine natürliche DNA-Aufnahmekompetenz oder andere Arten des horizontalen Gentransfers vor.

Bei gentechnischen Arbeiten gelangt DNA nur unter solchen Bedingungen in K. phaffii-Zellen, die die Zellwand und die Zellmembran hierfür durchlässig machen, zum Beispiel durch die Anwendung physikalischer (Elektroporation) oder chemischer Methoden (enzymatisch vermittelte Sphäroplastengenerierung, Polyethylenglykol/​Ca²⁺-Schock, LiCl) [27].

Neben der Aufnahme von DNA im Verlauf von artifizieller Transformation sind Hefen in der Lage, genetisches Material über die geschlechtliche Fortpflanzung zu vererben. Kreuzungen innerhalb der Spezies K. phaffii finden nur unter spezifischen Kulturbedingungen statt [5] und sind in natürlichen Umgebungen, wie zum Beispiel in Flusswasser­proben, nicht nachweisbar [23]. Ferner können K. phaffii-Stämme mit verwandten Spezies der Gattung Komagataella lebensfähige Hybride hervorbringen [28]. Spezies der Gattung Komagataella kommen im Exsudat europäischer und amerikanischer Bäume sowie in verrottendem Holz vor [28]. Die Entstehung von Hybridzellen bei der Kreuzung ist umso unwahrscheinlicher, je weniger eng die Spezies miteinander verwandt sind.

Insgesamt ist der Gentransfer bei K. phaffii nur in geringem Maße möglich und beschränkt sich auf eng verwandte Spezies.

Nach § 8 Absatz 1 GenTSV werden etablierte Laborstämme von Komagataella phaffii (NRRL Y-11430 und NCYC 2543 einschließlich Derivate) als Teil einer biologischen Sicherheitsmaßnahme anerkannt.

Etablierte Laborstämme der Spezies K. phaffii erfüllen die Voraussetzungen des § 8 Absatz 1 GenTSV für die Anerkennung als Empfängerorganismen für biologische Sicherheitsmaßnahmen. Sie sind sowohl wissenschaftlich sehr gut beschrieben als auch apathogen für den Menschen, Tiere und Pflanzen. Das Überleben von etablierten Laborstämmen von K. phaffii außerhalb gentechnischer Anlagen ist gut untersucht und es wurde gezeigt, dass die Hefen nur für kurze Zeiträume in Böden und Gewässern überlebensfähig sind. Diese Hefen stellen somit keine Gefahr für die Rechtsgüter nach § 1 Absatz 1 des Gentechnikgesetzes dar. Horizontaler Gentransfer von K. phaffii auf andere Mikroorganismen ist nicht zu erwarten.

Informationen dazu, ob einzelne Laborstämme von K. phaffii entsprechend den in dieser Stellungnahme festgelegten Kriterien als Empfängerstämme für biologische Sicherheitsmaßnahmen geeignet sind, werden in der Datenbank der Empfängerstämme für biologische Sicherheitsmaßnahmen gesammelt und zur Verfügung gestellt, die von der ZKBS-Geschäftsstelle geführt wird.

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